?MTT實驗步驟有哪些,有什么注意事項


MTT通常用于藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對體外培養的細胞毒性的測定以及細胞增殖及細胞活性測定。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。但是由于MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶于水,需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加,也會對實驗結果的準確性產生影響,而且溶解甲瓚的有機溶劑對實驗者也有損害。在MTT實驗步驟中要注意的是MTT有致癌性,用的時候小心,有條件最好帶那種透明的薄膜手套.配成的MTT需要無菌,MTT對菌很敏感;往96孔板加時不避光也沒有關系,畢竟時間較短,或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉。
 
MTT實驗步驟——貼壁細胞(http://www.kxkfub.live
1、收集對數期細胞,調整細胞懸液濃度,每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔,(邊緣孔用無菌PBS填充)。
2.、5%CO2,37℃孵育,至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物,原則上,細胞貼壁后即可加藥,或兩小時,或半天時間,但我們常在前一天下午鋪板,次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個,否則難以反應真實情況
3.、5%CO2,37℃孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀察。
4、每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應,可先離心后棄去培養液,小心用PBS沖2-3遍后,再加入含MTT的培養液。
5、終止培養,小心吸去孔內培養液。
6、每孔加入150ul二甲基亞砜,置搖床上低速震蕩10min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
7、同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)
 
MTT實驗步驟——懸浮細胞http://www.kxkfub.live
1、收集對數期細胞,調節細胞懸液濃度1×106/ml,按次序將①補足的1640(無血清)培養基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培養液稀釋 lg/ml,需預試尋找最佳稀釋度,1:10-1:20);③需檢測物10ul;④細胞懸液50ul(即5×104cell/孔),共100ul加入到96孔板(邊緣孔用無菌水填充)。每板設對照(加100(儲存液100 1640)。
2、置37℃,5%CO2孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀察。
3、每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),繼續培養4 h。(懸浮細胞推薦使用WST-1,培養4 h后可跳過步驟4),直接酶聯免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值)
4、離心(1000轉x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亞砜,置搖床上低速震蕩10 min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值。
5、同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜),每組設定3復孔。
在MTT實驗步驟中需要注意的是MTT法只能用來檢測細胞相對數和相對活力,但不能測定細胞絕對數。在用酶標儀檢測結果的時候,為了保證實驗結果的線性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內。配制MTT時用PBS溶解,也有人用生理鹽水配,60℃水浴助溶。

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